2019年04月18日,Genome Biology在线发表了中国科学院昆明动物研究所与北京百迈客生物科技有限公司共同合作文章“Whole genomes and transcriptomes reveal adaptation and domestication of pistachio” 中国科学院昆明动物研究所研究员吴东东为本文通讯作者,中国科学院昆明动物研究所曾琳,北京百迈客公司大项目负责人韩凤鸣,戴鹤为共同第一作者。本文绘制了开心果的基因组草图,并对其进行了大规模的基因组重测序并进行了比较基因组分析,表明,开心果的应激适应可能与细胞色素P450和几丁质酶基因家族的扩增有关。尤其重要的是,比较转录组学分析表明茉莉酸(JA)生物合成途径在开心果耐盐性中起着重要作用。此外,研究人员对93个栽培种和14个野生种(P. vera皇朝国际)基因组及35个亲缘关系密切的野生黄连木属基因组进行了重测序,以提供对种群结构、遗传多样性和驯化的见解与思路。

研究背景

皇朝国际SUIZHENONGYEMIANJIDEJIANSHAOHERENKOUDEZENGZHANG,LIANGSHIWEIJIZHENGCHENGWEIYIGERIYIYANZHONGDEWENTI。SHAMOYUEZHANDIQIULUDIBIAOMIANJIDESANFENZHIYI,SHIPINJIDEHUANJING,JIHUMEIYOUJIANGSHUI,TONGCHANGYOUGANZAOHEJIANXINGTURANG,YINCIDUIDADUOSHUZHIWUHEDONGWUDESHENGHUOTIAOJIANDOUHENBULI。RANER,YIXIESHAMODIQURENGKEYIZHONGZHIYIXIEZUOWU。DONGCHAZHEIXIEWUZHONGDEHUANJINGSHIYINGHEJINGJITEZHENG,YOUZHUYUZAIBUTONGDESHAMODIQUZHONGZHIHEFANZHIZHEIXIEZUOWU,ZHEIKENENGYOUZHUYUHUANJIESHIJIELIANGSHIWEIJI。

开心果(p.vera,2n=30,图1a)双子叶植物纲、无患子目和漆树科,是起源于中亚和中东的腰果家族成员。它是一种沙漠植物,对盐渍土有很高的耐性。开心果最近成为第五大坚果作物,除了具有经济、营养和药用价值外,对非生物胁迫也有很强的适应能力,被认为是一种能耐受干旱和盐碱胁迫的物种,是干旱和盐碱区重新造林的理想选择。

JINGUANJIYINZUCEXUDEKUAISUFAZHANYOUZHUYUFAXIANXUDUOZUOWUXUNHUAHEGAILIANGDEYICHUANJICHU,DANGUANYUKAIXINGUODEYANJIUQUEHENSHAO。JUGUJI,KAIXINGUODEJIYINZUDAXIAOYUEWEI600 MB,ZAHELVGAO。Moazzzam JaziDENGRENLIYONGQUANJIYINZUZHUANLUZU,TONGGUODUIZHAOHEYANCHULILIANGGEKAIXINGUOPINZHONGDEBIJIAO,FAXIANLENAIYANXINGXIANGGUANDEBIAOJIWUHEYINGJIFANYINGJIZHI。

ZAIBENYANJIUZHONG,WEILEGENGHAODILEJIEKAIXINGUOXUNHUADEFENZIJINHUALISHI,YANJIURENYUANZUZHUANGLEKAIXINGUODEJIYINZUCAOTU,BINGDUI107GEQUANJIYINZUJINXINGLEZHONGCEXU,BAOKUO93GEXUNHUAHE14GEYESHENGDEKAIXINGUOYIJI35GEBUTONGYESHENGHUANGLIANMUSHUWUZHONG。ZHENGHEJIYINZUHEZHUANLUZUXUEFENXIXIANSHI,KUOZHANGDEJIYINJIAZU(RUXIBAOSESUP450HEJIDINGZHIMEI)HEMOLISUAN(JA)SHENGWUHECHENGTUJINGKENENGCANYUYINGJISHIYING。BIJIAOQUNTIJIYINZUFENXIXIANSHI,KAIXINGUODAYUEZAI8000NIANQIANBEIXUNHUA,XUNHUADEGUANJIANJIYINKENENGSHINEIXIESHEJISHUMUHEZHONGZIDAXIAODEJIYIN,ZHEIXIEJIYINJINGLILERENGONGXUANZE。ZHEIXIEJIYINZUXULIEYINGGAIYOUZHUYUWEILAIDEYANJIU,YILEJIESHAMOZUOWUDENONGYEHEHUANJINGXIANGGUANTEXINGDEYICHUANJICHU。

材料方法

开心果(P.vera)二代测序denovo

测序材料:开心果栽培种“Batoury”;Illumina Hiseq 2500[包括两种类型小片段文库(270 bp和500 bp)]和六种类型 mate-pair文库(3 kb、4 kb、8 kb、10 kb、15 kb和17 kb);PacBio sequel

重测序:107个开心果(93个驯化+14个野生)、35个不同野生黄连木属物种;Illumina;

转录组:皇朝国际A:盐处理:Ohadi(根:salt treatment 3 rep vs control 3 rep;叶:salt treatment 3 rep vs control 3 rep);B:野生型和驯化型:Ohadi和Sarakhs[根:Sarakhs (wild 3 rep) vs Ohadi (control 3 rep);叶:Sarakhs (wild 3 rep) vs Ohadi (control 3 rep)];

ZHU:OhadiYUSarakhsFENBIEDAIBIAOPistacia veraDEBUTONGPINXI,OhadiBEIRENWEISHIXUNHUAXING,SarakhsSHIYESHENGXING)。

研究结果

1. 开心果的基因组进化

LIYONGIllumina Hiseq 2500PINGTAIZUZHUANGLE569.12 MbDEKAIXINGUOJIYINZUCAOTU,Contig N50WEI20.69kbHEScaffold N50WEI768.39 Kb。WEILETIGAOLIANXUXING,JINYIBUTONGGUOPacBio sequelXITONGZUZHUANGLE671 MBDEJIYINZUCAOTU,ContigN50WEI75.7 Kb,Scaffold N50WEI949.2 Kb。JIYINZUZHILIANGYUXIANQIANBAODAODEZHIWUJIYINZUXIANGYIZHI,YOUZHUYUYIXIELINGRENXINFUDESHUJUFENXI。ZHUANGPEICHICUNLVEDAYUGUJIDEJIYINZUCHICUN,ZHEIKENENGSHIYUKAIXINGUODEGAOZAHEDU(1.72%)YOUGUAN。ZHUANZUOYINZIZHANKAIXINGUOJIYINZUDE70.7%,QIZHONG46.75%WEILTR(ZHANGMODUANZHONGFUZHUANZUO)。CEGMAFENXIBIAOMING,96.94%DEHEXINDANBAIBIANMAJIYINBEIHUIFU。BUSCOPINGGUBIAOMINGYOU94.51%WANZHENGDEJIYINMOXING。

ZUOZHESHOUXIANJINXINGLEBIJIAOJIYINZUYANJIU,YIPINGGUGAIWUZHONGDEGULISHI。LIYONG9GEZHIWUJIYINZUDANKAOBEIJIAZUJIYINDEXITONGJIYINZUFENXIBIAOMING,KAIXINGUOZAI58BAIWANNIANQIANCONGGANJUZHONGFENLIBINGZAI105BAIWANNIANQIANCONGMAOGUOYANGZHONGFENLICHULAI。4DTVJIEGUOBIAOMING,KAIXINGUOJIYINZUZAIQIYUZHEIXIEWUZHONGDEFENHUAZHIHOUMEIYOUJINGLIPUXITEYIXINGDEQUANJIYINZUFUZHI。WENZHONGHAITONGGUOJIANGKAIXINGUOJIYINZUYUJICHUBEIZIZHIWUWUYOUZHANGJIYINZUJINXINGGONGXIANXINGFENXI,BIAOMINGMEIGEWUYOUZHANGQUYUZUIDUOYOUSANGEKAIXINGUOQUYU,ERMEIGEKAIXINGUOQUYUZUIDUOYOULIANGGEMAOGUOYANGQUYU(TU1b)。GONGXIANXINGFENXIZHICHIZHEIYANGYIGEJIELUN:KAIXINGUOZHONGMEIYOUFASHENGPUXITEYIXINGJIYINZUFUZHI,DANTAMENYUZHENSHUANGZIYEZHIWUZHONGFASHENGDEγFUZHIXIANGTONG,ERMAOGUOYANGJINGLILEPUXITEYIXINGJIYINZUFUZHISHIJIAN。

图1 开心果基因组进化
2. 开心果应激适应相关的扩张基因家族

皇朝国际WEILEJIESHIKAIXINGUOBIAOXING(RUNAIYANXING)DEYICHUANJICHU,LIYONGOrthoMCLTONGGUOSHIBIEBUTONGZHIWUZHIJIANDUTEHEGONGTONGDEJIYINJIAZULAIYANJIUJIYINJIAZUDEJINHUA。KAIXINGUOYUNINANJIE、GANJU、LEIMENGDESHIMIAN、PUTAOXIANGBIYOU9735GEGONGYOUJIYINJIAZU,ERHANYOU1381GEJIYINDE707GEKAIXINGUOYOUTEJIYINJIAZU。DUIZHEIXIEJIYINJINXINGGOYUKEGGFUJIFENXI,BINGDOUFAXIANLEXUDUOYU“FANGYUFANYING”YOUGUANDEJIYIN,QIZHONGBAOKUOXUDUOBAOHANNB-ARC domainHENBS-LRR domainDEJIYIN。ZHEIZHONGJIYINYIZHIWUKANGBINGXINGZHUCHENG,DUIKAIXINGUODEFANGYUFANYINGJUYOUXIANGDANGZHONGYAODEYIYI。

皇朝国际JIEXIALAI,ZUOZHEYANJIULEKAIXINGUOJIYINJIAZUDEKUOZHANGHESHOUSUO(TU1c)。YOUYUHENNANCONGJIYINJIAZUGUIMODESHOUSUOHUOYUWEIZAIGAICANKAOJIYINZUZHONGCHENGGONGZUZHUANGDEJIYINYOUGUAN,ZHEILIZHIFENXILEKUOZHANDEJIYINJIAZU。DUIKUOZHANJIYINJIAZUDEJIYINFUJIFENXIFAXIAN,TAMENZAIDAIXIELEIBIEZHONGFENGFU,RUTIELEI、HUANGTONGLEI、BEIBANTIELEIHESHENGWUJIANDESHENGWUHECHENG。JIYINJIAZUDEKUOZHANFASHENGZAIZHANGQIJINHUAZHIHOU,BINGTUIDONGLEHUANGLIANMUSHUHEGANJUSHUZHIJIANDEJINHUACHAYI,ERBUSHIKAIXINGUOCONGYEWAIXUNHUADEFEICHANGDUANQIDEJINHUA。YINCI,WOMENRENWEISHANGSHUJIYINDEKUOZHANKENENGYUYESHENGHUANGLIANMUZHONGYOUJIHUAHEWUDEDAIXIEYOUGUAN。YESHENGHUANGLIANMUDEZHIWUHUAXUESHAIXUANFAXIANLEXUDUOZHIWUHUAXUEWUZHI,RUSHENGWUJIAN、HUANGTONG、XIANGDOUSU、ZAICHUN、DANNING、TIELEIHEBEIBANTIELEI。

此外,丰富的术语“氧化还原过程”包含许多细胞色素P450基因,这些基因编码参与多种功能复杂代谢途径的蛋白质,并在多个过程中发挥重要作用,特别是在应激反应中发挥作用。在187个细胞色素P450基因中,我们发现许多可能具有耐盐功能。例如,透水性研究发现,CYP94家族基因表达水平的升高可减轻水稻的茉莉酸反应,增强水稻的耐盐性。在开心果的这些扩张基因家族中,有14个CYP94基因。大豆中,CYP82A3参与茉莉酸和乙烯信号通路,增强对盐碱和干旱的抗性,开心果扩张基因家族中有20个CYP82基因成员。毛果杨CYP714A3的异位表达增强了水稻的耐盐性,开心果扩张基因家族中有10个CYP714A基因。因此,一些细胞色素P450皇朝国际基因可能与开心果的耐盐性有关。

3. RNA-seq揭示了开心果盐适应的遗传机制

进一步研究开心果的耐盐性潜在遗传机制,研究者进行了盐度实验。开心果砧木(P.vera L.cv.Ohadi)的叶和根在正常条件和盐度条件下进行RNA测序。使用Tophat-Cufflinks-Cuffdiff pipeline,在盐水条件下处理的植物与对照之间表现出差异表达,鉴定214和461蛋白质编码基因分别在叶和根组织中(ncontrol = 3, nsalinity = 3, corrected P < 0.05,)。基因富集分析发现许多差异表达基因(31个基因)参与到“氧化还原进程”中(图2a,b)。像比较基因组分析一样,该类别中的15个基因是细胞色素P450基因,特别是CYP74A(即AOS),其编码细胞色素P450 CYP74基因家族的一个成员,其起到丙二烯氧化物合酶(AOS)的作用。这种酶催化茉莉酸酯合成中的第一步[即茉莉酸(JA)]。AOS中每千碱基外显子的表达片段(FPKM)值在叶片中从对照中的近0增加到盐水条件下的2163.75,在根中从对照中的1.87增加到盐水处理的87.74。研究者还发现了7个差异表达的基因(ChiC, TT4, ILL6, MYB108, MYB6, PRB1, and TIFY5A)被富集到“茉莉酸反应”中。以前的研究表明,干旱和高盐度导致水稻叶片和根部JA含量增加。盐度处理可以增加湿地物种鸢尾(Iris hexagona)中的内源JA水平。茉莉酸酯激活植物对生物胁迫(即病原体攻击)和非生物胁迫(即盐)的反应。在此,用盐水处理增加了在叶和根中参与茉莉酸反应的这些基因的表达水平(图2c)。这些基因的表达增加(例如,AOS作为酶催化茉莉酸酯合成中的第一步)应该增加茉莉酮酸酯的合成,因此,它们很可能被开心果用于应对盐胁迫。

差异表达的基因富集到“几丁质结合”,其中四种基因编码几丁质酶(CHIB, EP3, ChiC, AT2G43590)。植物几丁质酶涉及多种生物系统。植物中的一些几丁质酶是针对环境胁迫(如高盐浓度,寒冷和干旱)而表达的,并且可以通过植物激素如乙烯,茉莉酸和水杨酸来上调。例如,基因ChiC编码V类几丁质酶,其表达可由茉莉酸和拟南芥盐度引起的胁迫来诱导。研究者的转录组学分析表明,编码几丁质酶的基因和参与JA生物合成途径的基因可能有助于开心果适应盐水环境。

 图2 盐处理下开心果的转录组数据分析
4. 不同野生种间混和

为了研究开心果的种群历史和适应性进化,研究者对107个开心果基因组进行重测序,包括93个品种和14个野生开心果,平均测序深度为6-8X。作者还重新测序了来自不同近缘种的35个基因组,包括P.mutica,P.khinjuk,P.integerrimaP. palaestina。用stringent GATK pipeline,发现14.77百万个单基因变异位点,其中2.42百万个在基因区。使用邻近法和最大似然法的系统发育分析清楚地分离了5种不同的种群,即 P.vera, P.mutica, P. khinjuk, P. integerrima, and P. palaestina。通过TreeMix程序在一些物种之间检测到渐渗的信号,这表明杂交可能在自然界中的不同近亲之间发生,并且与植物中被发现的普遍杂交一致。然而,从其他开心果物种到驯化的开心果没有检测到渐渗,这种现象来源于野生的P. vera(图3)。

 图3 不同野生种间的基因渐渗
5. 开心果两步驯化历程

皇朝国际JIYUZHONGCEXUSHUJU,YANJIURENYUANTUICELEZHEIXIEWUZHONGDEYOUXIAOQUNTIDAXIAODEBIANHUA,BINGFAXIANZAI PleistoceneQIJIANFASHENGLEPINGJINGSHIJIAN,QIEZAI ~200 kyrQIAN,YOUXIAOQUNTIDAXIAOZENGJIA。XITONGFAYUSHUXIANSHIXUNHUAHEYESHENGKAIXINGUOZHIJIANDEFENLI(TU4a)。LIYONGδaδiTUISUANYESHENGHEXUNHUAKAIXINGUODEFENHUASHIJIANZAI ~8000NIANQIAN,ZHEIYUZAOZAIGONGYUANQIAN6750NIANJIUBIAOMINGKAIXINGUOZHONGZISHIYIZHONGCHANGJIANDESHIWUZHEIYIKAOGUJILUXIANGSI。WEILESHENRULEJIEKAIXINGUOZHONGZHIZHIJIANDEYICHUANGUANXI,YANJIURENYUANJINXINGLELIANGXIANGJINGDIANFENXI:QUNTIJIEGOUHEZHUCHENGFENFENXI(TU4b,c)。ZHEIXIEFENXIQINGXIDEXIANSHIZAIPEIZHONGZHIFENWEILIANGGEQUN。ZAIPEIZHONGGroup IDELDZUIGAO,ZAIPEIZHONGGroup IIHEYESHENGKAIXINGUODELDSHUAIJIANZHIXIANGJIN。Group IIBAOKUO Qazvini,ItaliaeiHEBadami

ZarandZAINEIDE5ZHONGLEIXINGDEGETI,QIEZHEIXIEZHONGZHIBEIJILUWEIGUDAIJUYOUZHONGZIDECAILIAO(TU4d)。YUXITONGFAYUSHUYIZHI,ZHEISANGEPINZHONGHANYOUJIAOGAOBILIDEYESHENGXUETONG(TU4e),ZHEIXIEJIEGUOZHICHILEQILIANGBUXUNHUADEGUOCHENG,CHUBUXUNHUA,RANHOUTONGGUOZUOWUYUZHONGJINXINGGAILIANG。

图4 野生和驯化开心果的系统发育关系分析
6. 开心果驯化的遗传机制

群体核苷酸多态性θπ分析揭示了驯化型种质的核苷酸多态性低于野生型种质,通过分析发现,栽培种质中基因组上的一些区域的多态性降低,这些区域可能含有受到人工选择的基因。此外,研究人员鉴定了栽培型和野生型样品分化水平增加的区域。在驯化和野生的开心果之间,在基因组上约有9.2 Mb的区域被鉴定为具有高水平的群体分化。栽培种间遗传多样性降低,且超过95%的阈值。遗传多样性减少的区域和群体分化增强的区域在驯化或育种过程中经历了选择性清除。共计有665个基因定位在该区域。研究人员定位了受正向选择的候选基因,其可能与驯化过程中重要的表型进化相关。在开心果驯化的过程中,其树形大小经历了人工选择(图5a)。研究人员发现了基因SAUR55(图5b),编码生长素应激蛋白,在植物的生长过程中发挥重要的作用,其在开心果的人工选择下进化而来。除此之外,基于也和根的转录组数据分析结果显示,驯化种与野生种相比,基因SAUR55表现出了显著增加的表达水平(图5c)。这些结果与在其它作物(如水稻和小麦)中生长素应激性基因的选择性清除的研究结果一致,并揭示了在作物驯化期间类似特征性状的人工选择。果实重量是作物驯化和育种期间最重要的特征之一,包括开心果。在栽培种中,品种成分与果实重量呈正相关(图4e)。这支持了一个结论,在开心果中,果实重量的人工选择发生在驯化与人工选择期间。研究人员指出,基因CYCD7-1在人工选择的进化下,野生种和驯化的栽培种之间具有高度的群体分化特征。该基因编码D型细胞周期蛋白,控制细胞分裂及种子发育过程中的生长率。CYCD7-1基因的过表达包括在胚胎和胚乳中的细胞增殖和细胞增大,其在拟南芥中导致种子过度生长。基因CYCD7-1在花粉和早期发育中显示特殊表达,但在叶和根中没有表达。因此,有希望在未来的实验中比较野生型和驯化型开心果在花粉和早起发育时期CYCD7-1基因的表达,研究人员提出在CYCD7-1基因上进行的人工选择可能会改变开心果的重量。

 图5 开心果果树大小的人工选择

结论

皇朝国际BENYANJIUWEIKAIXINGUODEJUBUSHIYINGHEXUNHUATIGONGLEYICHUANXUEJICHU。HUANGLIANMUSHUWUZHONGJIYINZUXULIEYOUZHUYUWEILAIDEYANJIU,YILEJIESHAMOZUOWUNONGYIHEHUANJINGXIANGGUANXINGZHUANGDEYICHUANJICHU。

 

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